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05 gen 2016

Articolo tradotto da: EWMA Journal 2014 vol. 14, no. 1 (scarica testo originale)

Il concetto di biofilm è emerso nella clinica nel corso dell’ultimo decennio.

Le Infezioni che coinvolgono i biofilm sono state documentate in tutte le parti del corpo umano, ed al momento si crede che la presenza di batteri del biofilm è equivalente ad infezione cronica. Una rapida ricerca in Pubmed rivela che c’è stato un drammatico aumento della pubblicazioni scientifiche sull’argomento, nonché nelle pubblicazioni per quanto riguarda le ferite con biofilm, che hanno raggiunto 600 pubblicazioni nel 2013.

A giudicare dal numero di pubblicazioni, sembra che i biofilm svolgano un ruolo significativo nelle ferite. Tuttavia, l’impatto del biofilm è spesso dibattuto, perché le ferite infette erano trattate anche prima di questo concetto.

In questa breve recensione, si affronterà il significato di biofilm e il loro ruolo nelle ferite, e sul discutere dei futuri compiti per la sfida.

I biofilm in breve

I batteri sono presenti in almeno due stati distinti:

- Planctonici e cellule sessili.

Le Cellule planctoniche sono classicamente definite come “i batteri a flusso libero in sospensione” in contrasto con lo stato di biofilm con cellule sessili, che è definito come “una comunità strutturata di cellule batteriche racchiusi in un polimero di matrice auto-prodotta e aderente ad una superficie inerte o vivente “.

I biofilm sono stati scoperti da uno dei primi microbiologi, lo scienziato olandese Antoine van Leeuwenhoek, nel 1650, ma la svolta reale riguardo a questo fenomeno si è verificata 328 anni più tardi, quando Costerton e colleghi pubblicato il loro lavoro su “Come attaccano i batteri” nel 1978. Dal 1978, la ricerca sui batteri biofilm è esploso.

Ora è stato stabilito che più vi è la crescita dei biofilm, maggiore è l’incremento dei batteri che causano infezione cronica; quindi sono caratterizzati da infiammazione persistente e distruzione dei tessuti. Queste infezioni croniche, sono infezioni che persistono nonostante l’antibiotico terapia e l’innata e adattiva risposta infiammatoria dell’ospite.

Tradizionalmente, i batteri del biofilm sono stati considerati come se stessero attaccati ad una superficie.

Tuttavia, le tecniche Fluorescent in situ hybridization (FISH) e Confocal laser scanning microscopy  (CLSM) effettuate su diversi siti di infezione, hanno dimostrato che i batteri non devono essere attaccati alla superfici per stabilire un’ infezione cronica, ma è sufficiente che generino delle matrici di microcolonie per aggregazione; in questo modo creano una barriera impenetrabile che non permette alle cellule immunitarie (es. Fagociti) di essere ospitate.

La sfida affrontata per quanto riguarda i biofilm nelle infezioni croniche, si trova nella loro tolleranza al trattamento con antibiotici.

La tolleranza all’antibiotico

La tolleranza agli antibiotici è stata studiata in numerosi modelli in vitro; questi studi dimostrano che è in grado di sopportare il trattamento con dosaggi molto elevati di antibiotici, che sono fino a 1000 volte il minimo di concentrazione inibente. Come accennato in precedenza, probabilmente la caratteristica più importante del biofilm è la sua tolleranza innata agli antimicrobici e antisettici. Qui giocano un ruolo fondamentale le molecole di crescita e di matrice. La matrice è composta da biofilm di macromolecole quali proteine, DNA extracellulare, e polisaccaridi. Questa matrice circostante i batteri nel biofilm ha dimostrato di ridurre la penetrazione e legame agli antibiotici. In aggiunta alla matrice, sembra che la popolazione del biofilm è costituita da batteri con diversa fisiologia, ad esempio, alcuni sono dormienti e alcuni sono in fase di crescita.

Con questa conoscenza, i regimi di trattamento con combinazioni di diversi antibiotici sono stati progettati con successo nel distruggere queste sottopopolazioni. La gestione di tali combinazioni è stata soddisfacente in una certa misura e sembra sopprimere l’infezione da biofilm. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, l’eliminazione di queste infezioni si è dimostrata impossibile, in quanto essa si ripresenta quando il trattamento viene interrotto.

Per la cura delle ferite, gli antisettici sono preferiti rispetto antibiotici.

Nelle nostre mani, la maggior parte degli antisettici (compreso l’argento e PHMB) sono molto efficaci contro i batteri planctonici e il biofilm immaturo. Tuttavia, quando è applicato su un biofilm maturo (cioè, quelli di età superiore a 24 ore), con bassa crescita e una matrice solida, possono inibire ulteriormente soltanto la crescita e impedire ai batteri di diffondersi al di là del biofilm (osservazioni non pubblicate), ma non risolvono l’infezione, così come è stato notato con terapia antibiotica.

La tolleranza del biofilm per la risposta immunitaria è la caratteristica d’infezioni croniche. I leucociti polimorfonucleati (PMN) sono normalmente le prime cellule che appaiono presso il sito di infezione, e il loro ruolo è quello di fagocitare i microrganismi e materiali esterni. Nonostante sia parte della risposta infiammatoria acuta, i PMN sono presenti anche nelle infezioni croniche e spesso circondano il biofilm.

Studi di biofilm Pseudomonas aeruginosa hanno dimostrato che questi PMN sono o paralizzati o uccisi da un importante fattore prodotto da Psedomonas aeruginosa è chiamato rhamnolipide. La lisi di PMNs provoca ulteriore infiammazione, attirando PMN supplementari e questo ciclo contribuisce ad un’infezione cronica da parte dello Psedomonas aeruginosa.

Come detto, le cellule di un biofilm hanno dimostrato di essere incorporate in una matrice di polisaccaridi auto-prodotti, proteine e DNA. La matrice gioca anche un ruolo nella tolleranza diminuendo la penetrazione di PMN e antibiotici. È interessante notare che, il DNA rilasciato da PMNs morti è fondamentale nello sviluppo iniziale del biofilm, rafforzandolo.

biofilm

Biofilm polimicrobico in epifluorescenza

Il biofilm nelle ferite

Le ferite con biofilm sono maggiormente a rischio d’ infezioni così come la perdita d’ integrità della pelle offre un ambiente bagnato, caldo e spesso ricco di sostanze nutritive che è benefico per la colonizzazione microbica. Alcuni dati ci suggeriscono che la presenza di alcuni batteri (ad esempio, P. aeruginosa) in determinate ulcere, possono indurre l’allargamento dell’ulcera ed il ritardato di guarigione. Recenti analisi di ferite croniche hanno individuato la presenza di batteri in crescita nel biofilm, spiegando così il motivo per cui queste ferite persistono.

Pubblicazioni riguardanti biofilm e ferite hanno raggiunto un totale di 600, l’anno scorso. Questo numero è impressionante e indica che i biofilm che svolgono un ruolo importante nella guarigione delle ferite. Tuttavia, non è chiaro se il ritardo guarigione della ferita è causato da batteri presenti nel biofilm, nello slough alla superficie della ferita o batteri situati più in profondità.

Hurlow et al. ha concluso da una piccola serie di casi che la comparsa di biofilm nelle ferite è molto diversa da quella slough e richiede strategie di gestione diverse per il suo controllo. Nel 2009, Fazli et al. ha trovato che la distanza del P. aeruginosa nel biofilm dalla superficie della ferita era significativamente maggiore di quello di S. aureus, suggerendo che la distribuzione dei biofilm nelle ferite non è casuale e che i biofilm più significativi sono situati nella zona più profonda della ferita . È stato pertanto suggerito che biofilm (cioè, P. aeruginosa) situato nelle regioni più profonde della ferita potrebbe giocare un ruolo nell’ arresto della guarigione.

Bjarnsholt et al. ha dimostrato che questi biofilm mantengono la ferita in uno stato infiammatorio cronico, che corrisponde ai risultati mostrati da un persistente afflusso di PMN, metalloproteasi di matrice elevati e gli squilibri in diverse citochine che si trovano nella ferita cronica.

Wolcott et al. hanno dimostrato nel 2008, che una strategia terapeutica mirata alla gestione del biofilm, migliora sensibilmente la frequenza di guarigione delle ferite.

I risultati dimostrano che prendere di mira le infezioni batteriche nelle ferite croniche è una componente importante per trasformare una ferita da non curabile a curabile.

Il biofilm impegnativo

Diagnosticare un biofilm è estremamente difficile cosi come lo è valutare l’impatto che questo ha sulla ferita e il valutare il trattamento. Le difficoltà della diagnosi del biofilm sono in larga parte dovuto alla sua piccola dimensione. Un recente studio in letteratura ha mostrato come i biofilm che causano infiammazione, raramente crescono sopra i 100 μm.

Quando si considera che la distribuzione spaziale di tali piccoli biofilm, viene rapportata ad una ferita che ha delle dimensioni assai maggiori, è facile immaginare come sia difficile identificare la colonia batterica; le probabilità di trovarla sono minime.

Oltre alla bassa probabilità di ‘trovare’ un biofilm durante il campionamento da una ferita, il batterio deve anche essere rilasciato dalla matrice. In aggiunta a queste difficoltà, il metodo di rilevazione potrebbe influenzare anche la diagnosi. La coltura di batteri è stata il gold standard, ma molti agenti patogeni della ferita sono di difficile coltura.

Metodi molecolari sono generalmente più sensibili se usati con cura. Tuttavia, anch’essi hanno loro limitazioni e il rilevamento di 16S rRNA è dimostrato difficile nella non crescita di biofilm.

Ultimamente si utilizzano modelli di biofilm. La sfortuna di questo utilizzo è che è difficile riprodurre un vero e proprio biofilm, anche perché mancano tutti i componenti dell’ospite come cellule, proteine ecc.

Ripensare a diagnosi e trattamento

Nonostante le suddette difficoltà nello studio, sembra che biofilm tolleranti impattino sulla guarigione delle ferite come impattano su altre ferite croniche. Come suggerito per altre infezioni con biofilm, vi è urgente bisogno di ripensare alla diagnosi e al trattamento.

L’esperto di ferita Keith Cutting ha scritto una recensione sulla pulizia della ferita, in cui ha proposto che dobbiamo ripensare al nostro approccio sul debridement.

Quando si studia l’impatto del biofilm e il loro trattamento nei pazienti, è importante combinare diversi metodi di rilevamento per evitare falsi negativi. Studiare la guarigione di ferite croniche è ulteriormente complicato dalla sfida e la longevità delle ferite che non guariscono.

Come accennato in precedenza, evitare che il biofilm crei batteri è quasi impossibile, e l’opzione migliore è quella di rimuovere la zona infetta, se possibile. Possono essere rimossi impianti infetti e cateteri , pazienti affetti da fibrosi cistica possono essere sottoposti all’espianto di polmoni infetti e le ferite possono essere pulite. Tuttavia, anche in questi casi, i biofilm sembrano ripetersi, e quindi è molto importante trovare e sviluppare nuove strategie per combattere i batteri nelle ferite.

Nelle nostre mani, una delle strategie più promettenti tra tutte le infezioni da biofilm correlate è la distruzione del biofilm combinata con un agente antimicrobico.      

Dopo l’interruzione fisica, i batteri all’interno si trovano improvvisamente al di fuori della matrice protettiva con accesso ai nutrienti e ossigeno, che potrebbe indurre la crescita. Così, una potenziale strategia potrebbe essere l’interruzione enzimatica o meccanica nella ferita.

Un agente lesivo per il biofilm potrebbe essere l’ultrasuoni. Alcuni studi hanno dimostrato che le onde ultrasoniche possono effettivamente migliorare l’efficacia degli antimicrobici. Studi clinici hanno anche mostrato una buona efficacia del debridement. Tuttavia, la diminuzione della conta batterica non era significativa. Questo non significante decremento dell’attività batterica può essere spiegato dalla difficoltà nell’identificare il biofilm , ma può anche essere suggerito dall’effetto positivo che deriva da una moltitudine di fattori quali reclutamento cellulare, la stimolazione, la sintesi del collagene, l’angiogenesi, e fibrinolisi.

La terapia di debridement con le larve di mosca nelle ferite che non guariscono, è stato approvata nel 2004 dalla FDA e ha dimostrato di possedere un effetto antibatterico in combinazione con altre proprietà di guarigione.

Uno studio interessante ha recentemente dimostrato che le larve combinano una distruzione con la destabilizzazione enzimatica di biofilm di ferita.

Come accennato nell’introduzione, DNA stabilizza tutti i biofilm. Apparentemente, oltre a nutrirsi fisicamente, secernono enzimi che degradano il DNA e quindi indeboliscono ulteriormente la struttura. Come gli ultrasuoni, anche le larve hanno effetti secondari positivi su guarigione di ferita.

Un altro esempio di attività demolitiva sinergica nei confronti del biofilm, è l’applicazione della terapia a pressione negativa (NPWT). Gli autori hanno dimostrato come la pressione negativa distrugge la matrice del biofilm, su impianti di pelle suina, facilitando la penetrazione degli antisettici.

2 risposte a “La sfida del Biofilm: come agire per distruggerlo”

  1. sciaban urhan zolata on

    La causa delle mie ulcere croniche e’ dovuta a neuroalgodistrofia/vasculopatia/circolazione arti inferiori
    pertanto il debridement a ultrasuoni e’ un supporto valido alle sofferenze fisiche.
    Grazie per le vs.preziose valutazioni.

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